Ионный ток BK каналы записываются с использованием методов патч зажим. BK каналов выражаются в<em> Xenopus ооцитов</em> Путем введения информационной РНК. Внутриклеточного раствора в процессе записи патча зажим контролируется перфузии системы.
Протокол, представленный здесь, предназначен для изучения активации большого проводимость, напряжение и Са 2 +-активированной K + (BK) каналов. Протокол также может быть использован для изучения структурно-функциональных отношений для других ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов 1. BK каналов широко выражается в различных тканях и был замешан во многих физиологических функций, в том числе регулирование гладких мышц, частота настройки внутренних волосковых клеток и регуляции нейротрансмиттеров выпуск 2-6. BK каналы активируются деполяризацию мембраны и внутриклеточного Са 2 + и Mg 2 + 6-9. Таким образом, протокол предназначен для управления и напряжение мембраны и внутриклеточные решение. В этом протоколе РНК БК каналы вводят в Xenopus laevis ооциты (этап V-VI), а затем на 2-5 дней инкубации при 18 ° С 10-13. Мембранные патчи, которые содержат одну или несколько BK каналы вырезали с наизнанку конфигурации с помощью патча зажим методы 10-13. Внутриклеточной стороне патч озарен искомые решения во время записи, так что канал активации при различных условиях могут быть рассмотрены. Подводя итог, мРНК BK каналы вводят в Xenopus laevis ооциты выразить канала белков на ооцит мембраны; методы патч зажим используется для записи ток, протекающий через каналы в контролируемых напряжением и внутриклеточных решений.
Система ооцитов выражение идеально подходит для электрофизиологических характеристик напряжения зависит от ионных каналов из-за относительно низкой фоне эндогенной каналов. Кроме того, так как она является переходным системы экспрессии, она обеспечивает эффективный метод проведен?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грантов R01-R01 и HL70393-NS060706 к JCJC является профессор биомедицинской инженерии на Спенсера Т. Олина фонда.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |