Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.
A maioria dos vetores de HIV-responsive expressão são baseados no promotor do HIV, a repetições terminais longas (LTR). Enquanto resposta a uma proteína HIV cedo, Tat, a LTR também é sensível aos estados de ativação celular e à atividade da cromatina locais onde a integração ocorreu. Isso pode resultar em atividade HIV-independentes de alto, e restringiu a utilidade do LTR baseado repórter às células marca HIV positivo 1,2,3. Aqui, construímos um vetor de expressão lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsiva, inúmeras sequências de DNA do HIV que incluem o elemento Rev-resposta e os locais de emenda HIV 4,5,6. O vetor foi incorporado um vírus repórter lentiviral, permitindo a detecção altamente específico de HIV replicação em populações de células vivas. A atividade do vetor foi medida pela expressão da proteína fluorescente verde (GFP). A aplicação deste vector como o aqui relatado oferece uma abordagem nova alternativa aos métodos existentes, tais como PCR in situ ou a coloração do antígeno HIV, para identificar o HIV de células positivas. O vetor também pode expressar genes terapêuticos para a experimentação básica ou clínica para alvejar HIV-positivos células.
Como com o anteriormente desenvolvidos vetores Tat-dependente expressão, o sistema Rev aqui descrito é uma exploração de um processo de HIV evoluiu. A inclusão de Rev-dependência torna o vetor de expressão LTR baseado altamente dependente da presença de HIV se reproduza. A aplicação deste vector como aqui relatado, um vírus HIV repórter-dependente, oferece uma nova abordagem nova para identificar o HIV de células positivas. O vetor permite o exame de células vivas, podem expressar todo o gene para a experimentação básica ou clínica, e como um lentivírus pseudo-digitado tem acesso a maioria dos tipos de células e tecidos.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho foi suportado em parte pelo Serviço de Saúde Pública conceder 1R01AI081568 de NIAID para YW e pelas generosas doações dos doadores e os pilotos do 2009 do passeio organizado pela AIDS NYCDC M. Rosen e Inc. Day2
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Biosafety Cabinet | ||||
37°C 5%CO2 incubator | ||||
Flow cytometer | FACSCalibur | |||
Centrifuge | Beckman | Allega™6KR | ||
4°C regrigerator | ||||
-20°C refrigerator | ||||
-80°C refrigerator | ||||
Cell counter | Nexcelom | Cellometer™ AutoT4 | ||
HEK293T cell line | NIH | |||
CEM-SS cell line | NIH | |||
Jurkat cell line J1.1 | NIH | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | ||
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | ||
HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | ||
HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | |||
pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | |||
pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | |||
pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | |||
pHCMV-G | ||||
10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | ||
2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | ||
1% paraformaldehy | Sigma Aldrich | 158127 | ||
Bleach | ||||
50ml Falcon tubes | BD Bioscience | 358206 | ||
5ml round bottom tubes | BD Bioscience | 352063 | ||
0.45μM Millipore filter | Millipore | SLHA033SS | ||
0.20μM Millipore filter | Millipore | SLFG85000 | ||
100mm Petri-dish | Sigma Aldrich | CLS430588 | ||
Size-exclusion column (100,000MW cut off) | SartoriuStedim biotech | VS2041 | ||
2ml frozen tube | Axygen | SCT-200 | ||
96-well plate | BD Bioscience | 353227 | ||
1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT- 175-C |