Summary

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Published: October 06, 2010
doi:

Summary

Questo articolo descrive diversi metodi di coltivazione<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilm su colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane. Questi protocolli possono essere adattati per studiare i diversi aspetti della formazione di biofilm, compresa la visualizzazione del biofilm, colorazione del biofilm, la misurazione della unità formanti colonia (CFU) del biofilm, e studiare la citotossicità biofilm.

Abstract

Biofilm batterici sono stati associati con una serie di diverse malattie umane, ma lo sviluppo di biofilm è stata generalmente studiata su superfici non viventi. In questo articolo, si descrivono i protocolli per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa sulle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane (cellule CFBE) crescere in coltura. Nel primo metodo (chiamato la statica Co-cultura Modello biofilm), P. aeruginosa viene incubata con cellule CFBE cresciuto come monostrati confluenti su piastre standard di coltura dei tessuti. Anche se il batterio è molto tossico per le cellule epiteliali, l'aggiunta di ritardi arginina la distruzione del monostrato abbastanza a lungo per formare biofilm sulle cellule CFBE. Il secondo metodo (chiamato la cella di flusso co-cultura Modello biofilm), comporta l'adattamento di un apparato cellulare biofilm flusso, che è spesso usato in biofilm ricerca, per ospitare un coprioggetto di vetro sostenere un monostrato di cellule confluenti CFBE. Questo monostrato viene inoculato con P. aeruginosa e una pompa peristaltica scorre mezzo fresco attraverso le cellule. In entrambi i sistemi, i biofilm batterici forma entro 6-8 ore dopo l'inoculazione. Visualizzazione dei biofilm è migliorata con l'uso di P. aeruginosa, i ceppi che esprimono costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP). La statica e Cella di flusso co-cultura saggi biofilm sono sistemi modello per l'inizio del P. infezione aeruginosa della fibrosi cistica (CF) del polmone, e queste tecniche permettono diversi aspetti di P. formazione di biofilm aeruginosa e virulenza da studiare, tra citotossicità biofilm, la misurazione di biofilm CFU, e la colorazione e la visualizzazione del biofilm.

Protocol

1. Statico Co-cultura Biofilm Modello La statica Co-cultura Modello Biofilm 1 usa CFBE41o-cellule (cellule CFBE), che sono immortalate le cellule originariamente sviluppato da un individuo con omozigote CF per il ΔF508-mutazione CFTR 2,3,4. Cellule CFBE dovrebbe essere seminate ad una concentrazione di 10 6 cellule / pozzetto in un 6-pozzetti di coltura o 2 x 10 5 in un 24-pozzetti coltura tissutale in minima quantità di terreno essenziale (MEM) arricchito con 10%…

Discussion

I biofilm sono comunità di batteri che si formano in risposta a stimoli ambientali. Questi segnali ambientali globali portare a cambiamenti normativi all'interno di ogni batterio, con conseguente legame ad una superficie, l'aggregazione, la produzione di esopolisaccaridi, e altri fenotipi quali aumento della resistenza agli antibiotici 10. Nel corso degli ultimi due decenni, molte prove ha sostenuto l'ipotesi che i biofilm giocano un ruolo importante nella patogenesi delle infezioni croniche. Per…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare G. O Toole per la guida e suggerimenti per lo sviluppo di questi modelli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fibrosi Cistica (ANDERS06F0 per GGA, STANTO07RO e STANTO08GA a BAS), il National Institutes of Health (T32A107363 per GGA e R01-HL074175 a BAS), e il Centro nazionale per le risorse Centri di Ricerca di Eccellenza di Ricerca Biomedica (COBRE P20-RR018787 di BAS).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber   Bioptechs, Butler, PA 060319131616  
FCS2 chamber controller   Bioptechs, Butler, PA 060319-2-0303  
40 mm glass coverslips   Bioptechs, Butler, PA PH 40-1313-0319  
MEM   Mediatech, Manassass, VA #10-010-CV  
MEM without phenol red   Mediatech, Manassass, VA Mediatech, Manassass, VA  

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Cite This Article
Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

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