우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작은 이전에 보고된 최소화합니다.
Stomata은 공장 내부와 환경 사이의 가스 교환에 책임이있는 식물 표피 자연 채용하고 있습니다. 그들은 빛의 강도, 이산화탄소 농도, 그리고 상대 습도 (RH)를 포함한 외부 요인에 대응 stomatal 기공을 닫으 수있는 경비 세포, 한 쌍의에 의해 형성된다. stomatal 기공은 나뭇잎으로 병원체 진입, 질병 개발을위한 중요한 단계의 주요 경로입니다. 최근 연구는 기공의 폐쇄가 Arabidopsis 식물의 세균성 질병 개발을 최소화에 효과적이라는 사실을 발표했습니다; 공장 타고난 면역의 중요한 부분을. 이전, 우리는 박테리아를 (. Melotto 외 2006) 생활 stomatal 반응을 평가하기 위해 표피 껍질을 사용한 적이 있지만 식물 표피 껍질을 세균 세포 모두에 유리한 환경 조건을 유지 도전했습니다. 잎 표피는 경비 세포 electrophysiological 실험 MES 버퍼 (10 MM KCl, 25 MM MES – 코, 산도 6.15)와 살아 있고 건강하게 만들어 줬어 수 있습니다. 그러나,이 버퍼가 박테리아 중지를위한 적합하지 않습니다. 한편, 세균 세포는 시간의 오랜 기간 동안 표피 껍질을 유지하기 위해 적절한되지 않습니다 물이 살아 보관하실 수 있습니다. 물 위에 표피 필 수레, 4 시간 이내에 건조 공기에 노출되어있는 껍질에있는 세포가 실험을 실시하는 시간을 제한하는 경우. 경비 세포에 특정 자극의 효과를 평가하기위한 이상적인 방법은 stomatal 생리학과 가능한 많은 식물의 자연 환경에 최소한의 간섭을 제시해야합니다. 우리는 그러므로, 잎 입힐 수있는 총알과 조작이 크게 쉽게 재현할하고 안정적인 stomatal 분석을 제공하는 목표로 최소화되는 박테리아를 살 stomatal 응답을 평가하는 새로운 방법을 개발했습니다. 프로토콜은 propidium 요오드화물의 (PI), 세균의 정지와 리프 얼룩의 부화하고, 공촛점 현미경 스캐닝 레이저에 따라 나뭇잎의 관찰과 함께 그대로 잎의 얼룩을 기반으로합니다. 마지막으로,이 방법은 밀접하게 식물이 병원균에 의해 공격하는 아래의 자연 조건을 모방 조건을 사용하여 오랜 기간에 걸쳐 동일한 라이브 잎 샘플의 관찰을 허용합니다.
우리는 다른 치료에 반응 stomatal 쉽게 평가 있도록 그대로 잎 조직에서 stomatal 조리개를 측정하는 직선 전달 절차를 제시합니다.
우리가 모델 시스템 Arabidopsis / 모나스 syringae를 사용하여 결과를 발표했지만, 손상 잎 stomatal 분석은 잠재적으로 어떤 식물 세균의 조합을 수행할 수 있습니다. 프로토콜은 쉽게 다른 식물과 세균성 병원균의 성장 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 전체 원칙과 절차는 동일하게 유지. 또한,이 방법은 미생물을 살아 경호 세포뿐만 아니라 출력의 기능을 연구하고자하는 연구자에게 도움이 될뿐 아니라 나뭇잎의 자연 환경을 유지 조건에서 다른 자극과 화학 약품에 있습니다.
전체 잎의 두께와 고르지 지형으로 인해 이미지에 어려울 수 있습니다. 이 문제는 그것이 평면 낳는 있도록 슬라이드에 나뭇잎의 중간 정맥을 제거하고 공촛점 현미경을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 그러나, 형광 현미경의 다른 종류는 잎 표면의 고해상도 이미지를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
본 연구는 보건 국립 연구소에서 그랜트와 알링턴 텍사스 대학 MM에 기금을 설치하여 지원했다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | ||
Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | ||
Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | ||
Sodium Chloride | VWR | 7647-14-5 | ||
Agar | Bio Express | J637-2500G | ||
Plant growth chamber | ||||
Shaker incubator | ||||
Laser scanning confocal microscope |