우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 – 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.
세포 분열의 정확한 측정이 서서히 나누어 세포가 분석되면 점점 더 복잡해지는되어 실험 생물학의 근본적인 도전입니다. 세포 분열을 감지하기 위해 설립 방법은 세포 배양 등 carboxyfluorescein DI – aetate succinimidyl 에스테르 (CFSE) 같은 ki67 또는 PCNA와 같은 mitogenic 항원의 단백질 검출과 같은 중요한 염료의 희석하고, thymidine의 analogues 지속 현미경에 의해 직접적인 시각화를 포함합니다. Thymidine의 analogues는 tritiated thymidine, 브로모 – deoxyuridine (BrdU), 클로로 – deoxyuridine (CldU)와 iodo – deoxyuridine (이두)을위한 단백질 감지 및 ethinyl – deoxyuridine에 대한 화학 검출을위한 무선 감지를 포함한 다양한 방법에 의해 감지 수 있습니다 (이두). 우리는 성인 생쥐의 조직으로 다른 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 우리의 방법은 조사가 정확하게 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 수 있습니다. 최적화 immunostaining 프로토콜로 접근 시간이 연장 기간에 대한 마우스로 관리하는 안전한 식수를 통해 관리 매우 낮은 선량의 thymidine analogues를 검색할 수 있습니다. 따라서, 우리의 기술은 매우 긴 조직에서 세포 회전율을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 최적 immunofluoresent 얼룩 결과는 췌장, 피부, 뱃속, 간, 부신, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 뇌를 포함한 여러 조직 유형에 형성될 수 있습니다. 우리는 또한 조직 내에 종양 발생 변환을 확인하려면이 기술을 적용했습니다. 우리는 더 이상 중계 – 확장의 세포 조직의 성장이나 갱신에 기여하는지 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 이러한 의미에서, thymidine의 analogues의 연속 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.
세포 회전율을 라벨에 thymidine 기반의 접근 방식에 대한 우리의 접근 방식은 생명 의학 연구에 많은 잠재적인 응용 프로그램을하고 있습니다. 지금까지 우리는 췌장에 집중해야하지만, 우리는 세포 피부의 매출, 뱃속, 간, 부신, 신장, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 조혈 및 뇌 1 조사이 전략을 적용했습니다. 세포 회전율은 조직에서 조직 다양하기 때문에, 상표 전략은 이익의 기관에서 가장 뛰어난 정보를 얻을 정의해야합니다. 모리슨과 동료 일일 각각 조혈 2 라벨 위해 CldU과 이두를 사용합니다. 쿤과 동료 재생 myocardium 3 세포 분열을 감지하는 사일 각 CldU과 이두를 사용합니다. 반대로, 우리가 동물의 세 1,4-6과 같은 최소한의 세포 회전율과 췌장 아일 레츠 이내에 기저 세포 회전율, 조직을 라벨 총 9개월하는 CldU과 이두를 사용했습니다. 연구 조직의 항상성 내에서 세포 회전율을 정의하기위한 상표 전략의 가장 확실한 잠재적인 응용 프로그램입니다. 하지만 우리의 기술은 여러 가지 다른 가능성이 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 증가 복제 초점 영역이 쉽게 CldU 또는 이두 5 증가 결합하여 식별할 수 조직 내에 종양 발생 변환을 식별하기 위해이 기술을 적용. 모리슨과 동료 일일 각각의 조혈 줄기 세포의 라벨 유지 행동 2 테스트하기위한 CldU과 이두를 사용합니다. 우리는 또한 대중 교통 – 확장의 세포가 조직 하나의 성장 또는 갱신에 기여하는지 확인하기 위해 순차 thymidine의 아날로그 라벨을 적용합니다. thymidine의 analogues이 응용 프로그램을 연속적인 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.
Thymidine의 analogues은주의없이 사용할 수 없습니다. 합성 thymidine의 analogues은 나누어 세포 잠재 toxicities을 가지고, 그들의 사용은 이론적으로 성장하는 동물 세포 회전율을 손상 수 있습니다. Thymidine의 analogues는 암 환자를위한 에이전트를 radiosensitizing로 사용되고 있고, 세포 회전율을 느리게 수 있습니다. 따라서 우리는 조심스럽게 관심을 자신의 조직에 잠재 toxicities에 대한 조사를 위해 조사를 촉구합니다. 예를 들어, Trumpp와 동료들은 체계적 BrdU는 조혈 줄기 세포는 세포주기 7 입력할 수 있으리란 걸 발견. 예를 들어, 러터와 동료 높은 선량의 thymidine analogues은 췌장 8 개발에 독성이있는 것으로 보여집니다. 최근 KineMed에서 Hellerstein와 동료, 병원은 BrdU 행정부가 독점적인 중수 라벨 기술 9를 사용 16~25%하여 내부 아일릿 확산을 느리게 것으로 나타났습니다. Hellerstein 및 동료에 의해 사용되는 전체 아일릿 준비 총 아일릿 준비 정도로 50 %를 구성하는 수 많은 다른 내분비 및 비 내분비 세포 유형을 포함. 그러나, 우리는 BrdU의 장기간 주입은 ki67 표현을 사 의한 측정으로, 젊은 성인 마우스의 베타 세포 증식에 영향을 미치지 않습니다 찾습니다. 마찬가지로, CldU 및 이두의 장기적인 관리는 베타 세포 대량 확장 1 손상하지 않는 것. 또한, 베타 세포 증식 속도는 시간과 단 몇 시간 (속도가 상당 기간에 정규화)을 표시 아르 생쥐의 오랜 기간 동안 BrdU으로 표시 생쥐 사이에 같습니다. 함께, 이러한 결과는 생쥐 안전하게 thymidine의 analogues의 장기 낮은 선량 관리를 용인할 수있는 것이 좋습니다. 아직도, 우리는 췌장 베타 세포의 성장에 thymidine analogues하여 잠재적인 독성을 배제할 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 thymidine의 analogues와 마우스를 라벨링 때 컨트롤을 수행하고, 그러니 잘 다른 수사를 촉구하기 위해 계속합니다.
순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 함정과 기술 도전없이는되지 않습니다. 결과적으로, 컨트롤 슬라이드 특히 중요합니다. 우리는 1 다양한 조직으로 이루어져 제어 슬라이드를 생성) 만 CldU와 라벨이 붙지만 마우스,.. 2)에만 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 3) 순차적으로 CldU 그리고 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 4) 순차적으로 이두 그리고 CldU 처음에 역순으로 표시되었습니다 쥐,. 물만으로 표시 모의 아르 5) 쥐. CldU과 이두와 라벨 학습 때, 조사는 항상 관심의 조직에서 슬라이드의 모든 5 위의 세트와 함께 전체 프로토콜을 수행한다.
CldU과 이두 사이에 약간의 교차 반응 모두의 thymidine analogues와 라벨에 불행하지만, 부득 이한 단점입니다. CldU과 이두 기술은 원래 종 (마우스 및 쥐)에 BrdU에 대한 파생되었다 antisera 사이에 동질성의 차이에 따라 달라집니다. 우리 프로토콜은 복잡하면서, 이러한 교차 반응을 최소화하도록 설계되었습니다. 따라서, 우리는 프로토콜의 단계 (들)을 빼먹는 고려 조사 중에주의를 촉구합니다. 특히, 우리는있다마우스 및 쥐 사이에 교차 반응 아르 보조 antisera 문제가 발생했습니다. 이것은 완전히 마우스와 쥐 사이에 상호 adsorbed 아르 잭슨 antisera의 사용으로 최소화하실 수 있습니다.
우리는 때때로 적절하게 thymidine 결합을 감지하기 위해 실패합니다. 이러한 경우에 그것은 시약 또는 단계가 작동되지 않은 결정하기 위해 긍정적인 제어 슬라이드를 사용하는 매우 중요합니다. 문제는 일반적으로 antisera, 드라이 슬라이드, 또는 불충 분한 핵 permeabilization의 나쁜 aliquots 예정이다. 우리는 성공적으로 이두와 태아를 개발 라벨에 실패했습니다. 따라서, 모든 조직은 이두로 투과 수 있습니다.
이중 thymidine의 아날로그 라벨에 대한 CldU와 이두에 대한 대안이 수평선에있다. 이두 (5 – ethinyl – 2 deoxyuridine) 구리 촉매를 클릭 화학 감지 10,11위한 기판 수 있습니다. 에듀 검출 방법의 DNA 가닥이 분리를 요구하고, 유동세포계측법의 12 분석하므로 매우 의무가 없습니다 않습니다. 이두는 BrdU 10과 반응을 교차 호환되지만되지 않습니다. 이두는 췌장 베타 세포 13 장 L 세포 14 표피 15 등 다양한 마우스 조직의 세포 회전율을 계량하는 데 사용되었습니다. 에듀 순간 (500mg 당 천달러 미국)에 매우 비싼입니다. 하지만, 에듀 감지 훨씬 더 민감한 BrdU 검출 10 개 것 같습니다. 그러므로, 그것은 대신 CldU 및 이두의 이두와 BrdU을 결합하기 위해 경제적으로 가능 수 있습니다. 이 방법은 또한 triply 에듀, CldU, 그리고 이두에 대한 표시 마우스에서 세포 분열의 세 가지 다른 라운드의 감지를 허용 있습니다.
요약, 순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 세포 회전율을 검출하는 새로운 접근 방식입니다. 우리는 우리의 접근 방식이 더 정확하게 세포 분열을 계량 다른 과학자들을 수 있도록 희망하고 조직 항상성의 새로운 패러다임을 열 것으로 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
JDRF, NIH (R01 – DK081469), 펜실베니아의 연방 (재생 의료 부여 4100043362에있는 우수를위한 센터), 천의 월 (바실 오코너 초보 학술 연구 수상), 그리고 펜실베니아 DERC 조종사의 대학 지원 및 타당성 부여 (DK19525).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedical | 0210547891 | ||
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedical | 0210035701 | ||
4% Paraformaldehyde | USB | 19943 | ||
10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | ||
XYLENES | VWR | EM-XX0060-4 | ||
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | ||
PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | ||
Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
Hydrochloric Acid | VWR | BDH3028-2.5LG | ||
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | ||
Mouse Anti BrdU | BD Pharmingen | 347580 | ||
Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical | OBT0030 | ||
Cy2 donkey anti-rat | Jackson Immuno | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). | |
Cy5 donkey anti-mouse | Jackson immuno | 715-175-151 | See above | |
Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | ||
YFP Filter | Chroma | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel | |
Cy3 Filter | Chroma | 49004 ET Cy3 | ||
Cy5 Filter | Chroma | 49006 ET Cy5 | ||
ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |