Summary

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Published: October 15, 2010
doi:

Summary

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה של<em> תסיסנית</em> הזחלים לצורך הדמיה התנועה של שלפוחית ​​GFP axonal מתויג על הפסים microtubule.

Abstract

הבהרת המנגנונים של תחבורה axonal הוכיח להיות חשוב מאוד בקביעת כיצד פגמים הובלה למרחקים ארוכים להשפיע על מחלות נוירולוגיות שונות. פגמים בתהליך זה חיוני יכול להיות השפעות מזיקות על ההתפתחות העצבית ואת תפקוד. פיתחנו פרוטוקול לנתיחה אשר נועד לחשוף את<em> תסיסנית</em> עצבים סגמנטלי הזחל כדי להציג תחבורה axonal בזמן אמת. אנחנו צריכים להתאים את פרוטוקול הדמיה לחיות מזו שפרסם Hurd ו סקסטון (1996) המשמש immunolocalizatin עצבים סגמנטלי הזחל. דיסקציה זהירה ותנאי חיץ תקין הם קריטיים עבור למקסם את תוחלת החיים של הזחלים גזור. כאשר נעשה כראוי, זחלים גזור הראו התחבורה שלפוחית ​​חזקים 2-3 שעות בתנאים פיזיולוגיים. אנו משתמשים בשיטה כטב"מ-GAL4<sup> 1</sup> להביע את ה-GFP-tagged APP או שלפוחית ​​synaptotagmin בתוך האקסון יחיד או אקסונים רבים עצבים סגמנטלי הזחל באמצעות שונות העצבית GAL4 הנהגים. סמנים מתויג fluorescently אחרים, למשל mitochrondria (MitoTracker) או lysosomes (LysoTracker), יכול להיות מיושם גם הזחלים לפני הצפייה. GFP-שלפוחית ​​ותנועת החלקיקים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות אורכי גל שונים.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים הכן את הכנת המאגר לנתיחה על ידי הוספת מרכיבים הבאים: 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 מ"מ MgCl 2, 2mm KCl, HEPES 5mm, סוכרוז ו 36 מ"מ 1000 PH, 7.2 מ"ל ל ולסנן לעקר. 2. הכנה Dissection <ol style=";…

Discussion

בתחום ההדמיה vivo התחבורה שלפוחית ​​סינפטית בתוך העצבים תסיסנית הזחל סגמנטלי הוא כלי רב עוצמה ללימוד מנגנוני בתחבורה axonal. השתמשנו בעבר בפרוטוקול זה על מנת להעריך את הדינמיקה בתוך התחבורה עצבים הזחל להביע מורחבת חוזר polyQ להבהיר כיצד התפשטות חוזרת להשפי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג'ון ר Oishei קרן.

ח"כ נתמך על ידי פרס תלמיד מחקר על ידי CURCA ב UB.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 Pair Micro Dissection Scissors   Fine Scientific   Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter
2 Pair Forceps   Fischer Scientific   Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps
Box of Dissection Pins   Fine Scientific   Minutien Pins 0.1mm diameter

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
  3. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).

Play Video

Cite This Article
Kuznicki, M. L., Gunawardena, S. In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons. J. Vis. Exp. (44), e2151, doi:10.3791/2151 (2010).

View Video