Induction et d'évaluation de la recombinaison commutateur de classe dans purifiée cellules B murines
Summary
Après l'exposition des antigènes, des sous-populations de cellules B activées subissent un processus connu sous le nom commutation isotypique (CSR) pour produire des isotypes d'anticorps avec les différentes fonctions effectrices. Le protocole décrit dans le présent rapport explique comment la RSE peut être induite et analysé<em> In vitro</em> Aux fins d'étudier la fonction des cellules B.
Abstract
L'immunité humorale est la branche du système immunitaire entretenu par les cellules B et médiée par la sécrétion d'anticorps. Lors de l'activation des lymphocytes B, le locus d'immunoglobuline subit une série de modifications génétiques pour modifier la capacité de liaison et de la fonction effectrice des anticorps sécrétés. Ce processus est mis en évidence par un événement de recombinaison génomique connue comme la commutation isotypique (RSE) dans lequel l'isotype des anticorps IgM par défaut est substitué à l'un des IgG, IgA ou IgE. Chaque isotype possède des fonctions effectrices distinctes rendant ainsi la RSE crucial pour le maintien de l'immunité.
Diversification de l'locus d'immunoglobuline est médiée par l'enzyme cytidine désaminase induite par activation (AID). Une vidéo décrivant schématiquement ce processus en détail est disponible en ligne (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). L'activité de l'AID et la voie de la RSE sont fréquemment étudiés dans l'évaluation de la fonction des cellules B et l'immunité humorale chez la souris. Le protocole décrit dans le présent rapport présente une méthode d'isolement des cellules B de la rate de souris et une stimulation ultérieure avec lipopolysaccharide (LPS) à induire le passage à la classe IgG3 (pour les autres isotypes d'anticorps voir tableau 1). En outre, les cellules fluorescentes coloration colorants carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) est utilisé pour surveiller la division cellulaire des cellules stimulées, un processus crucial pour la commutation isotypique 1, 2.
Le règlement de l'AID et le mécanisme par lequel la RSE se sont pas encore claires et donc passer des tests in vitro de classe fournissent une méthode fiable pour les tests de ces processus dans les divers modèles de souris. Ces tests ont déjà été utilisés dans le contexte de déficience du gène en utilisant des souris knockout 3. Par ailleurs, in vitro, de commutation de cellules B peut être précédée par transduction virale pour moduler l'expression des gènes par ARN ou knockdown l'expression du transgène 4-6. Les données de ces types d'expériences ont influencé notre compréhension des activités d'aide, la résolution de la réaction de la RSE, et l'immunité à médiation d'anticorps chez la souris.
Protocol
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus donne un dosage standard pour analyser l'expression AID et la fonction lors de la commutation de classe du primaire des cellules B murines. Ce protocole utilise LPS bactérien pour induire le passage d'IgM IgG3, même si des modifications aux médias stimulation peut être faite pour induire le passage à d'autres isotypes (résumées dans le Tableau 1 8, 9).
Nous avons noté que, pour des raisons encore inconnues, du sérum de veau fœta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au laboratoire Martin pour des discussions utiles. Cette publication est soutenue par une subvention de l'Institut canadien de recherche en santé (MOP-89783). AM est soutenu par une recherche du Canada Chaire de niveau II Award.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
