ويتم رصد نشاط كربوكسيل محرض يسين عن طريق تفاعل الركيزة L – يسين وكادافيرين المنتج مع 2،4،6 trinitrobenzensulfonic الحمضية لتشكيل adducts التي الذوبان في الفرق التولوين.
كولاي هي البكتيريا المعوية التي هي قادرة على النمو أكثر من مجموعة واسعة من قيم الرقم الهيدروجيني (درجة الحموضة) 9 — 5 1 ، وبشكل لا يصدق ، قادرة على البقاء على قيد الحياة حمض المدقع تؤكد بما في ذلك المرور عبر المعدة الثدييات حيث درجة الحموضة يمكن أن تقع على أنها منخفضة ودرجة الحموضة 1-02 فبراير. لتمكين هذه مجموعة واسعة من بقاء درجة الحموضة الحمضية ، E. القولونية يمتلك أربعة أنواع مختلفة من الأحماض الأمينية decarboxylases محرض decarboxylate أن الأحماض الأمينية الركيزة بهم بطريقة بروتون التي تعتمد على رفع درجة الحموضة وبالتالي الداخلية. وdecarboxylases تشمل حمض الغلوتاميك decarboxylases جدة وGadB 3 ، وجهاز أبوظبي للاستثمار كربوكسيل أرجينين 4 ، كربوكسيل يسين LdcI 5 و 6 و 7 كربوكسيل الأورنيثين SpeF. كل هذه الانزيمات الاستفادة بيريدكسال – 5' – phospate كعامل المشترك (8) وظيفة مع antiporters الركيزة المنتج ، التي تعمل على إزالة الغشاء الداخلي للمنتجات نزع الكربوكسيل الخارجية في المتوسط مقابل 2 الركيزة الطازجة. في حالة LdcI ، يسمى antiporter يسين – كادافيرين CadB. مؤخرا ، مصممون على التركيب البلوري للأشعة السينية من LdcI إلى 2.0 ، واكتشفنا رواية صغيرة جزيء منضمة إلى LdcI المنظم استجابة صارمة غوانوزين 5' – ثنائي فسفات ، 3' – ثنائي فسفات (ppGpp) 14. استجابة صارمة يحدث عندما الخلايا المتنامية باطراد تجربة الحرمان المغذيات أو واحد من عدد من الضغوط الأخرى 9. نتيجة لذلك ، تنتج خلايا ppGpp الأمر الذي يؤدي إلى تتالي إشارات وبلغت ذروتها في التحول من النمو المتسارع للنمو ثابتة المرحلة 10. لقد أثبتنا أن ppGpp هو المانع محددة من LdcI 14. نحن هنا وصف مقايسة كربوكسيل يسين ، من تعديل المقايسة التي وضعتها فان وآخرون 11 ، التي استخدمناها لتحديد نشاط LdcI وتأثير pppGpp / ppGpp على هذا النشاط. تفاعل نزع الكربوكسيل LdcI يزيل مجموعة α – L – كربوكسي ليسين وينتج غاز ثاني أكسيد الكربون وكادافيرين البوليامين (1،5 – diaminopentane) 5. يمكن أن يكون رد فعل L – يسين وكادافيرين مع 2،4،6 – trinitrobenzensulfonic حمض (TNBS) عند درجة الحموضة العالية لتوليد N ، N' bistrinitrophenylcadaverine – (TNP – كادافيرين) و N ، N' bistrinitrophenyllysine – (TNP – يسين) ، على التوالي 11. ويمكن فصل TNP – كادافيرين من ليسين ، كما TNP السابق قابل للذوبان في المذيبات العضوية مثل التولوين في حين أن الأخيرة ليست (أنظر الشكل 1). تم تحديد مجموعة خطية من مقايسة به تجريبيا كادافيرين المنقى.
في مقايسة كربوكسيل يسين ، هو رد فعل TNBS مع الأمينات الأولية من L – يسين وكادافيرين لتشكيل ليسين وTNP – TNP – كادافيرين adducts (الشكل 1). نظرا لوجود مجموعة من حمض الكربوكسيلية على TNP – يسين ، وهذا ناتج إضافة تبقى قابلة للذوبان في الماء بينما TNP – كادافيرين ، التي تفتقر إلى مجموعة حم?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور الدكتور مايكل كشل] (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MA ، الولايات المتحدة) لارسال لنا سلالات بكتيرية ، وبلاسميدات ، والبروتوكولات اللازمة. نشكر الدكتور جون غلوفر (قسم الكيمياء الحيوية في جامعة تورنتو) لاستخدام لوحة SpecraMax القارئ. المملكة المتحدة هي المستفيدة من العلوم الوطنية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة دراسية عليا ، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة برنامج التدريب الاستراتيجية في البيولوجيا البنيوية للبروتينات غشاء مرتبط بمرض ، وزمالة جامعة تورونتو المفتوحة. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (MOP – 67210) لواه.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
96-well quartz plate | Hellma | |||
VWR Digital Heatblock | VWR | |||
ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |