함께 Langendorff 모드 절연 심장 재관류,<sup> 31</sup> P NMR 분광법은 하나의 실험으로 생화학 및 생리학 분야가 조화를 이루고 있습니다. 프로토콜은 높은 에너지 인산 내용과 동시에 physiologic 기능을 모니터링하는 동안 마음에 매출의 동적 측정을 위해 수 있습니다. 제대로 수행되면,이 심장 에너 지학의 평가에 유용한 기술입니다.
새로 개발 했나 마우스 모델은 심혈관 질환의 분자 변경과 모델 사이의 인과 관계를 결정하는 강력한 연구 도구되고 있습니다. 분자 생물학은 신호 경로의 주요 변화를 식별이 필요하지만, 그것은 기능적 중요성에 대한 대리하지 않습니다. 생리는 손상에 metabolites의 생화 학적 평가와 생리를 결합, 함수의 질문에 대한 답변을 제공할 수 있지만, 마음을 박동하는 심장 기능과 에너 지론의 전체 사진 수 있습니다. 년 동안, 우리 연구실은이 작업을 수행하는 핵 자기 공명 (NMR) 분광법와 함께 격리 심장 perfusions을 활용하고 있습니다. 심장의 에너 지론을 수행하여 측정하는 동안 왼쪽 심실 기능이 Langendorff 모드 절연 심장 perfusions에 의해 평가됩니다<sup> 31</supperfused 마음> P 자기 공명 분광법. 이러한 기술은 phosphocreatine 및 ATP 수준의와 함께 심장 기능의 인덱스가 마음을 치고로 동시에 측정할 수로. physiologic 또는 pathologic 스트레스가 제정하는 동안 또한, 이러한 매개 변수는 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어, 국소 빈혈 / reperfusion 또는 높은 작업 부하 도전 프로토콜을 채택 수 있습니다. banding 대동맥이나 심장 병리학의 다른 모델의 사용뿐만 아니라 경향이있다. 에 관계없이 프로토콜 내에서 변종의 유전자 변형 마우스 모델의 분자 수정의 기능과 활기찬 의미가 적절하게 관련 효소 및 대사 경로에 새로운 통찰력에 이르는, 설명하실 수 있습니다. 따라서,<sup> 31</sup고립 perfused 중심부에> P NMR 분광법은 심혈관 질환의 동물 모델에서 중요한 연구 기법이다.
Langendorff – perfused 절연 마우스 중심부에 31 P NMR 분광법은 신뢰성과 재현성 데이터를 제공합니다. 3, 4 단, 그것은 LV 풍선의 대동맥과 삽입의 cannulation은 안정적인 심장의 성능을 수 있도록 적절하게 이러한 수행하는 필수적입니다 NMR 안에있는 동안 관. 또한, 온도 조절은 적절한 기본 기능을 달성하기 위해 답해야 해요. 좋은 analyzable NMR 스펙트럼을 얻기에있는 중요한 요인은 노이즈 비율로 신호를 증가하고있다. 이것은 최적의 "조정"을 보장하고 샘플의 "shimming"에 의해 얻을 수 있습니다. 마찬가지로 프로토콜 텍스트에 언급된 사전 심장의 삽입에 대한 표준 샘플의 사용이 용이하게하실 수 있습니다. 적절한 크기의 "샘플"이 또한 도움이 그것이다. 100 개 미만 MG 무게 하트는 일반적으로 낮은 PCR 및 ATP 신호 있으므로 수집 시간이 증가 좋은 인 스펙트럼을 얻기 위해 필요합니다 제공합니다.
심장 기능과 에너 지론에 관한 추가 정보를 저장하기 위해 기존의 프로토콜을 수정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 다른 지방산의 조합 (낮은 높은 농도에서), 락트 산, ketones, 그리고 인슐린의 존재를 포함할 수 있습니다 혼합 기판 버퍼와 마음을 perfused 있습니다. 재관류 버퍼의 안정 동위 원소의 사용 (즉, 기판 표시 13 C)와 함께, 우리는 TCA 사이클을 표시 아세틸 COA의 상대적 기여에 의해 기판 활용도를 추정하는 능력을 보유하고 있습니다.이 응용 프로그램에 5-7 우리는 isotopomer을 수행 13 C NMR 분광법 13 C3 – 13 C4 – 글루 탐 산염의 분석. 이것은 재관류 프로토콜의 끝에 마음을 동결 – 클램핑 및 냉동 조직의 추출을 수행합니다. 이것은 분석이 별도의 설치 매개 변수와 함께 다른 프로브의 사용을 필요로 추가 실험을 것입니다. 31 P NMR 분광법을 사용하여 심장에 2 deoxyglucose 인산염의 시간 의존 축적을 모니터링하는 동안 다른 응용 프로그램은 버퍼에 deoxyglucose과 포도당의 대체가 포함됩니다. 이 방법은 심근 포도당 이해의 측정을 위해 수 있습니다. 또한 7, 8, 저희 연구실은 국소 빈혈 / reperfusion 높은 워크로드 도전 구성된 재관류 프로토콜의 심장 기능과 에너 지론을 분석했다. 6, 8-10은
요약, 절연 마우스 마음 31 P NMR 분광법은 복잡한 장비의 사용을 필요로하는 기술적으로 도전적인 절차입니다. 그러나, 그것이 산출하는 데이터를 새로 개발 했나 보지 마우스 모델의 기능과 에너 지론을 분석하고자 연구에 귀중한 것입니다. 저희 연구실 들어,이 기술은 심장 기능, 에너 지론 및 대사에 대한 스트레스의 다양한 결과에 대한 우리의 이해에 매우 중요했습니다. 1, 11, 12
The authors have nothing to disclose.
저자는 실험의 NMR 분광 부분 동안 그녀에 대한 지원 린 스펜서 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 기금 R01 HL059246 국립 연구소, R01 HL067970, R01 HL088634 (박사 티안로)와 F32 HL096284 (박사 Kolwicz로)의 보조금에 의해 지원되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma Aldrich | M7506 |
EDTA | Reagent | Sigma Aldrich | E1644 |
Potassium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | P4505 |
Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma Aldrich | S6297 |
Sodium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | S7653 |
Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma Aldrich | C5080 |
D-Glucose | Reagent | Sigma Aldrich | G7528 |
Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma Aldrich | P2256 |
Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker | |
PowerLab 4/30 | Equipment | ADInstruments | ML866/P |
LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments | MLS260/6 |
Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments | ML224 |
STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments | ML175 |
Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments | ML172 |
Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT0699 |
10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 |
Polyethylene tubing PE10 | Equipment | Becton-Dickinson | 427401 |
Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT844 |
Polyethylene tubing PE50 | Equipment | Becton-Dickinson | 427411 |
Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 |
McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 |
Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments | RS-5650 |
Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex – 1 |