Количественный анализ ДНК двунитевых разрывов на основе γH2AX очагов стал бесценным инструментом, особенно в области радиационной биологии, для оценки радиочувствительности тканей и воздействию радиации изменения соединений. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов в образцах тканей.
ДНК двунитевых разрывов (ДР) особенно смертоносным и генотоксического повреждения, которые могут возникнуть либо эндогенного (физиологического или патологического) процессов или экзогенных факторов, в частности, ионизирующего излучения и радиомиметическое вещество соединений. Фосфорилирование H2A гистонов вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX, является ранний ответ на ДНК двунитевых разрывов<sup> 1</sup>. Это событие фосфорилирования опосредуется фосфатидил-inosito 3-киназы (PI3K), семейство белков, атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM), ДНК-протеинкиназа каталитической субъединицы и банкоматов и RAD3 связанных (ATR)<sup> 2</sup>. В целом, DSB индукции приводит к образованию дискретных ядерных γH2AX очаги, которые могут быть легко обнаружены и количественно с помощью иммунофлуоресценции микроскопии<sup> 2</sup>. Учитывая уникальную специфичность и чувствительность этого маркера, анализ γH2AX очагов привело к широкому кругу приложений в области биомедицинских исследований, особенно в радиационной биологии и ядерной медицины. Количественного определения γH2AX очагов была наиболее широко исследовалось в системах клеточных культур в условиях ионизирующего излучения, вызванная ДР. Помимо сотовых радиочувствительности, иммунофлюоресценции основан анализов были также использованы для оценки эффективности излучения модифицирующих соединений. Кроме того, γH2AX был использован в качестве молекулярного маркера для изучения эффективности различных DSB вызывающие соединений и недавно обставляется как важный маркер старения и болезней, особенно рака<sup> 3</sup>. Кроме того, иммунофлюоресценции методы, основанные были адаптированы для обнаружения костюм и количественного определения очагов γH2AX<em> Исключая виво</em> И<em> В естественных условиях</em<sup> 4,5</sup>. Здесь мы демонстрируем типичные иммунофлюоресценции методом для обнаружения и количественного определения γH2AX очагов в тканях мышей.
Для этой демонстрации мы использовали ткани легких мышей из необработанных Balb / с мышами и с мышиной модели хронические аллергические заболевания дыхательных путей. Мы количественно различия в количестве очагов на клетку с несколько более высокие средние наблюдается в поврежденных л…
The authors have nothing to disclose.
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы. ММТ выражает благодарность за экспертную помощь и совет от д-р Ольга Седельникова из Национального института здоровья.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |