ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。
培養胚と成体の骨格筋細胞は、異なる用途の数を持っている。この章で説明するミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞の比較的大きな数字を隔離するための堅牢で信頼性の高い方法です。著者らは、野生型およびジストロフィー筋の骨格筋細胞の増殖特性を分析するためのマイクロ解剖外植片培養を使用している。組織の成長の各コンポーネント、すなわち細胞生存、増殖、老化や分化は、ここで説明する方法を使用して個別に分析することができます。成長のすべてのコンポーネントの正味の効果は、外植片の伸長率を測定する手段を確立することができます。マイクロ植方法はここで説明されているように、さまざまな筋肉の種類と幅広い年齢層からの初代培養を確立するために使用することができ、胚骨格筋の前駆体の分離を有効にするために、著者によって組み込まれています。
一意に、マイクロ植培養は生体移植のために拡大して使用することができる骨格筋幹細胞(SMSC)の行をクローン(単一細胞由来)を導出するために使用されている。 生体内に移植SMSCがとしての機能、組織特異的、衛星細胞の動作をこれは、骨格筋線維の再生に貢献するだけでなく、マイクロ植法を用いて培養に再単離することができる未分化幹細胞の小さなプールのように(サテライト細胞のニッチで)保持されている。
マイクロダイセクション外植片培養を確実かつ再現性良く増殖Myf – 5正の骨格筋幹細胞(SMSC)の非常に高い割合(〜85%)を含む細胞集団を分離するために使用することができます。厳密に制御された培養条件下で一次外植培養を遺伝的変異マウスのSMSCの成長挙動を特徴付けるために使用することができると分化過程のin vitroでの解析の詳細のための筋管を生成する手段として使用することができますここで説明する。これらの培養物の入念なメンテナンスや操作は、長期培養と拡張することができます。メソッドを使用すると、単一のセルの希釈によって外植片培養物からのクローナルな骨格筋幹細胞株を導出することも可能ですここで説明する。 "馴化培地"は、高密度培養のためのこれらの細胞の正常な要件を模倣するために使用され、クローニング手順の間に分離された単一細胞の増殖を達成するために。方法は(胚、成人、老人、成体組織に(変更あり)に適用され、マウスに加えて、人間(ラオとスミス、未発表)を含む他の種の骨格筋から細胞、ニワトリ胚や魚を隔離するために使用することができます。鮭)24。クローン由来のSMSCは、筋肉内移植によるin vivoで解析することができますし、注入されたこれらの条件下で、SMSCは、ハイブリッド筋線維を形成するためにホストの筋管で結合します。筋肉内注射SMSCは、腫瘍を形成しないと彼らは衛星幹細胞niche.These細胞による内在性コントロールの対象となることを示唆し、注入後の年以上の衛星細胞の位置にホストの筋肉で発見されている注入から再単離することができる12カ月以上19ホストの注入後の増殖SMSCのようなホスト。
The authors have nothing to disclose.
我々はshRNAiシャトルベクターの彼の贈り物のためにパトリックパディソンに感謝。アンジェラスローンは、 図3のGFPのRNAi画像を生成する。我々はまた彼らのサポートについては、次の助成団体に感謝:
筋ジストロフィーキャンペーン承認番号RA2/592/2は、承認番号02BHM04、王立協会の助成金番号574006.G503/1948./JEとBBSRCの助成金番号6/SAG10077スパークス。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM/F12 1:1 mix | Sigma-Aldrich Company | Liquid medium: (Dulbecco’s Modified Eagles’s medium and Ham’s F12 medium, 1:1 v/v) | ||
100× Glutamine (200mM) | Sigma-Aldrich Company | Diluted in medium to a 1× concentration of 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R) | ||
Fetal calf serum (FCS) | From a number of different companies | Batch tested on primary cultures and skeletal muscle cell lines. 10-20% supplement to liquid media | ||
Heraeus Labofuge 300 | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Lab centrifuge capable of reaching 1,000 rpm | ||
15 ml Falcon centrifuge tubes | Fisher Scientific | Must fit lab centrifuge | ||
Tissue culture plasticware (25, 75 or 175 mm2 tissue culture vessels; 96-well tissue culture plates. 60 mm Petri dishes). | Nunc (available from Fisher Scientific in the UK) | |||
Humidified CO2 incubator (Heraeus) | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Ours is copper lined, recommended for reducing contamination | ||
Sterile hood with laminar air flow (Heraeus) | Heraeus and distributors of Heraeus equipment | Ours is a Class II hood – suitable for use with Human tissues | ||
Water Bath | Grant Equipment | Maintained always at 37°C | ||
Inverted microscope | Leica DMIRB, Leica Instruments, UK) | |||
70% Ethanol | For sterilization (animals, dissection instruments) and swabbing benches, hood, etc. | |||
Calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich Company, UK | Cell culture-tested PBS (Dulbecco’s formula) is purchased as a ready-mixed powder or in tablet form and made up with doubledistilled water before sterilization by autoclave. PBS consists of 2.68 mM potassium chloride (KCl); 1.47 mM potassium phosphate monobasic (KH2PO4); 0.137 M sodium chloride (NaCl); and 8.1 mM sodium phosphate dibasic (Na2HPO4). PBS can be prepared from scratch as follows: 200 mg KCl, 200 mg KH2PO4, 8 g NaCl and 1.15 g Na2HPO4/l of double-distilled water followed by sterilization by autoclave. | ||
CryoTube vials | Nunc (see above) | |||
A Neubauer haematocytometer and coverslips | Fisher Scientific, UK | For estimating cell counting | ||
Hand counter | Fisher Scientific, UK | |||
Dissection microscope, Zeiss Stemi 1000 | Zeiss, UK | For preparation of explants | ||
Small sterile hood | ||||
Sterile dissection instruments (including Jeweler’s forceps) | Sterilised by autoclave | |||
Sterile plastic collecting vessels (7 ml bijou tubes or 20ml universals) | Nunc (Fisher Scientific) | |||
Warm PECM | Constituents purchased from Sigma-Aldrich, UK as above | Made up in the sterile hood and warmed to 37°C in the tissue culture waterbath. DMEM:F-12 supplemented with 20% FCS, 1% glutamine and + 1% penicillin & streptomycin solution | ||
Dispase (50 μg/ml, equivalent to 6 units/mg) | Available from MP Biomedicals, UK | |||
10 μg/ml 4_,6 Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI). | Sigma-Aldrich, UK | For microscopic visualization of apoptosis and mitosis | ||
Vectashield fluorescent mounting fluid | Vector Laboratories, UK | |||
Fluorescent upright microscope with ultraviolet filter (we use a Nikon Eclipse E600) | Nikon, UK | |||
Digital camera and imaging software (we use a Nikon Coolpix 995 camera; A Nikon D3 camera | Nikon, UK | |||
OpenLab4.0a software | Improvision, UK | |||
Photoshop CS4 | Adobe |