Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도
Summary
이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.
Abstract
trophectoderm의 사양은 포유류의 발전의 초기 분화 행사 중 하나입니다. trophectoderm의 mediates 주입에서 파생된 및 trophoblast의 일족이 태반의 태아 부분을 생성합니다. 결과적으로,이 혈통의 개발은 배아 생존을 위해 필수적입니다. 마우스 blastocysts에서 trophoblast 줄기 (TS) 세포의 유도 먼저 다나카에 의해 설명되었다<em> 외.</em> 1998. 적절한 자극 후 무대 및 세포 유형의 특정 마커의 trophoblast 특정 재산과 자신의 표현을 보존하기 위해 TS 세포의 능력은 초기 placentation 이벤트 recapitulating 떨어지던 trophoblast의 혈통 개발을 조사하기 위해 가치있는 모델 시스템을 제공합니다. 또한, trophoblast 세포는 자연 게놈 증폭을받은 몇 체세포 유형 중 하나입니다. trophoblast의 polyploidization를 기본 분자 경로가 해명되기 시작했지만, trophoblast의 게놈 증폭의 생리적 역할과 장점은 크게 어려운 남아 있습니다. 문화 polyploid trophoblast 세포에 diploid의 줄기 세포의 개발이 만들어<em> 예 생체내</em건강과 질병의 게놈 복제 및 불안정성의 규제 메커니즘을 elucidating위한> 시스템은 훌륭한 도구입니다. 여기 애기 출판 수정과 이전의 보고서를 기반으로 한 프로토콜을 설명<em> 외.</em> 2008.
Protocol
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 프로세스가 TS 세포 라인을 확립 uteri와 실험 절차에서 E3.5 blastocysts를 수집 보여줍니다. 또한 TS 세포의 stemness를 유지하고 차별화된 세포에 자신의 차별을 유발하는 조건을 설명합니다. 순수 TS 세포 라인을 얻기 위해 두 가지 중요한 단계는 가지의 disaggregation에 대한 타이밍 (9 단계)이며, 첫 번째 통로 (11 단계)를 처리. 그것은 광범위한 blastocyst 단계 11 (Kunath 외., 2005)에 TS ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원래 프로토콜 쟈넷 Rossant 감사합니다. 이 연구는 WH하는 보건 부여 CA106308 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
Reagents
TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.
Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.
Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.
PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.
FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).
Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).
References
- Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages. PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).
- Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development. 132, 1649-1661 (2005).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
