Summary

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

Published: April 22, 2010
doi:

Summary

Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.

Abstract

Il modello di macaco rhesus è attualmente il miglior modello disponibile per l'HIV-AIDS rispetto alla comprensione della patogenesi e per lo sviluppo di vaccini e terapie<sup> 1,2,3</sup>. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale delle risposte immunitarie cellulari, in particolare la produzione di citochine intracellulari di CD4 + e CD8 + T, oltre che i sottoinsiemi memoria individuale. Abbiamo ottenuto precise misure quantitative e qualitative per la produzione di interferone gamma (INF-) e interleuchina (IL) -2 in entrambi i CD4 + e CD8 + T cellule del macaco rhesus PBMC stimolati con PMA più ionomicina (PMA + I). I profili delle citochine erano diverse nei diversi sottoinsiemi di celle di memoria. Inoltre, questo protocollo ci ha fornito la sensibilità per dimostrare anche le frazioni minori di specifico antigene CD4 + e CD8 + sottogruppi di cellule T nei campioni di PBMC da macachi rhesus immunizzati con un vaccino cocktail busta peptide HIV sviluppate nel nostro laboratorio. La tecnica di citometria a flusso multicolore è un potente strumento per identificare con precisione le diverse popolazioni di cellule T<sup> 4,5</sup> Con citochine capacità di produzione<sup> 6</sup> In seguito a stimolazione aspecifica o antigene-specifiche<sup> 5,7</sup>.

Protocol

Le procedure per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi di cellule T di memoria può essere diviso in quattro parti: 1) Preparazione delle cellule e stimolazione antigenica, 2) indicatore colorazione superficiale, 3) colorazione delle citochine intracellulari e 4) La citometria a flusso analisi. 1. Preparazione delle cellule e la stimolazione antigenica Sia appena isolato e crio-conservato le cellule mononucleate del sangue periferico …

Acknowledgements

Dr. Pramod Nehete e la signora Bharti Nehete macaco di sangue e campioni PBMC; Questo lavoro è stato parzialmente supportato con fondi dal NIH concedere AI 46969, e tutti i terreni di coltura cellulare sono stati prodotti dai Media Central Laboratory, che è finanziato dal NIH concedere CA 16672.

Materials

Solution and Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
  • Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents

  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies

  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

References

  1. Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
  2. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
  3. Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
  4. Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
  5. Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
  6. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
  7. Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
  8. Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
  9. Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
  10. De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
  11. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).

Play Video

Cite This Article
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

View Video