Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay
Summary
Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages.
Abstract
Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages. Linéarisé λ ADN est modifiée pour avoir une biotine à l'extrémité d'un brin, et un fragment de la digoxigénine sur l'autre extrémité du même brin. La fin biotinylé est attaché à une lamelle de verre fonctionnalisée et la fin digoxigeninated à une petite perle. L'assemblage de ces attaches ADN perlent à la surface d'une cellule de flux permet un flux laminaire à être appliqués à exercer une force de traînée sur le talon. En conséquence, l'ADN est étiré proche et parallèle à la surface de la lamelle à une force qui est déterminé par le débit (Figure 1). La longueur de l'ADN est mesurée par le suivi de la position de la bille. Différences de longueur entre l'ADN simple et double brin sont utilisées pour obtenir des informations en temps réel sur l'activité des protéines de réplication sur la fourche. Mesure de la position de la bille permet une détermination précise des tarifs et processivities de l'ADN de déroulage et de polymérisation (figure 2).
Protocol
Discussion
Il est important de s'assurer que la force de traînée exercée sur les billes par flux laminaire ne pas influencer les activités enzymatiques des protéines de réplication. Par exemple, une force de 3 PN qui correspond à un débit de 0,012 ml / min n'affecte pas la réplication du brin d'ADN de premier plan. Cela ne va cependant affecter les activités enzymatiques qui ont lieu pendant la synthèse d'ADN coordonnés, et il doit donc être réduite à 1,5 pN. La force de traînée peut être facileme…
Acknowledgements
Le développement de l'ADN qui s'étend de dosage a été aidé par Paul Blainey, Bong Jong-Lee, et Samir Hamdan. Ce travail est soutenu par le National Institutes of Health accorde à Charles Richardson (GM54397), et Antoine van Oijen (GM077248).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
References
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
