בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי
Summary
במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור של<em> תסיסנית</em> הנוירונים ההיקפיים באמצעות מיון מהיר מגנטי חרוז בסיוע אסטרטגיה התא. RNA המתקבלים בתאים מבודדים יכול לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל ניתוחים microarray.
Abstract
<em> תסיסנית</em> מערכת העצבים ההיקפית (PNS) הוא מודל רב עוצמה עבור חוקרת את התהליכים המורכבים של פיתוח עצב המורפוגנזה דנדריט ברמות פונקציונלי מולקולרית. כדי לסייע בניתוחים אלה, פיתחנו אסטרטגיה לבידודה של subclass של נוירונים PNS נקרא arborization הדנדריטים (דה) נוירונים היה בשימוש נרחב לחקר המורפוגנזה דנדריט<sup> 1,2</sup>. נוירונים אלה קשה מאוד לבודד כאוכלוסייה טהור, בין השאר כתוצאה המופע שלהם נמוך ביותר שלהם, קשה להשגה מיקום מתחת לציפורן קשה הזחל כיטיניות. השיטה החדשה שפותחה שלנו מתגבר על אתגרים אלה, והיא מבוססת על העשרת תא מהיר באמצעות נוגדן ספציפי מצופה חרוזים מגנטיים. עבור מחקרים מגנטי שלנו מיון חרוז, השתמשנו בגיל בהתאמה third הזחלים instar להביע עכבר CD8 מתויג היתוך חלבון ה-GFP (<em> כטב"מ-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> תחת שליטה של אחת arborization הדנדריטי בכיתה IV (דה) נוירון ספציפי<em> כייס (פ.פ.ק.)-GAL4</em> הנהג<sup> 4</sup> או את השליטה GAL4 נוירון ספציפי פאן דה<sup> 21-7</sup> הנהג<sup> 5</sup>. אמנם זה פרוטוקול כבר מותאם לבידוד PNS תאים אשר מחוברים לקיר הפנימי של לציפורן הזחל, על ידי שינוי כמה פרמטרים, פרוטוקול אותו יכול לשמש כדי לבודד הרבה סוגי תאים שונים המחוברים לציפורן בשלבי הזחל או גלמי של פיתוח (למשל epithelia, שרירים, oenocytes וכו '), או סוגי תאים אחרים מאיברים הזחל תלוי דפוס GAL4 ספציפיים ביטוי הנהג. RNA בודד בשיטה זו היא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בקלות עבור ניתוחים גנומית במורד כגון הביטוי microarray מחקרים פרופיל גנטי. גישה זו מציעה כלי חדש רב עוצמה לבצע מחקרים על מבודד<em> תסיסנית</em> הדנדריטים (דה) arborization נוירונים ובכך לספק תובנות הרומן לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס המורפוגנזה דנדריט.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן הוא אופטימיזציה עבור בידוד וטיהור של נוירונים הפריפריה אשר להיצמד בחוזקה לפני השטח הפנימי של לציפורן third תסיסנית הזחל instar באמצעות מיון מגנטי חרוז אסטרטגיה התא. אמנם יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה במיוחד כדי לבודד תסיסנית נוירונים דה, יישומים של פרוט?…
Acknowledgements
אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ו-Office ג'ורג' מייסון האוניברסיטה מכללה (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
