מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.
Abstract
Microbiome אדמה הוא מאגר עצום נחקרו יחסית של גיוון גנטי וחדשנות מטבולית קשורה באופן הדוק עם מזין ואת זרימת האנרגיה בתוך המערכות האקולוגיות של כדור הארץ. טיפוח עצמאית גנומית סביבתי, המכונה גם metagenomic, גישות מבטיח גישה חסרת תקדים למידע זה גנטי לגבי שחזור מסלול ההקרנה פונקציונלי טיפולית ערך גבוה המרה תהליכים ביומסה. עם זאת, microbiome אדמה עדיין אתגר בעיקר בשל הקושי בהשגת משקל מולקולרי גבוה DNA באיכות מספיק לייצור להכניס ספריה גדולה. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול לחילוץ משקל מולקולרי גבוה, ה-DNA הגנומי של חיידקים הקהילה מקרקעות ו משקעים. איכות של הדנ"א הגנומי מבודד אידיאלי לבניית סביבתי גדול להכניס ספריות גנומית עבור במורד הזרם יישומים רצף ההקרנה.
ההליך מתחיל עם תמוגה התא. קירות התא ממברנות של חיידקים הם lysed על ידי שני כוחות מכניים (שחיקה) וכימיות (β-mercaptoethanol). הדנ"א הגנומי מבודד מכן באמצעות חיץ החילוץ, כלורופורם, isoamyl אלכוהול אלכוהול איזופרופילי. מאגרים מועסק תמוגה ואת הצעדים החילוץ כוללים isothiocyanate guanidine ו ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) כדי לשמור על שלמות ה-DNA גנומי מולקולרי גבוה במשקל. בהתאם ליישום הזרם שלך, ה-DNA הגנומי מבודד יכול להיות מטוהרים נוסף באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation שיפוע, אשר מפחית זיהומים כולל חומצות humic. הליך השאיבה הראשונה, לוקח כ 8 שעות, למעט שלב כימות DNA. Ultracentrifugation שיפוע CsCl, הוא תהליך יומיים. במהלך ההליך כולו, הדנ"א הגנומי יש לנהוג בעדינות כדי למנוע גז, להימנע vortexing חמורים, pipetting קשים חוזרים.
Protocol
אני חלק: הפקת DNA נוהל 1. 8 שעות נדרשים, לעיבוד 6 דגימות כולל כימות של ה-DNA. לפני שתתחיל החילוץ, יהיה עליך ועלי מראש צמרמורת מרגמה, ו מרית מקפיא -20 ° C או ?…
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, קולומביה הבריטית ידע ופיתוח הקרן, הגנום קולומביה הבריטית ואת קולומביה הבריטית משרד יערות טווח לתמיכה במחקרים מתמשך של פוריות הקרקע ביער. SL נתמך על ידי מענק ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.
Materials
Recipe
* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol
Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)
4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)
100 μl
0.5M EDTA
20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS
Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*
100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]
100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]
200 ml
5 M NaCl
300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.