Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.<sup> 1,2</sup> Dieser Beitrag stellt eine neuartige Tier-serumfreien Verfahren zur Isolierung und Expansion von ECFC aus heparinisiertem erwachsenen menschlichen peripheren Blut mit gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) vermindert das Risiko von Anti-Rinder-Impfung.
Abstract
Dieser Beitrag stellt eine neuartige Recovery-Strategie für die endotheliale koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) aus heparinisiertem aber ansonsten unmanipulierten erwachsenen menschlichen peripheren Blut innerhalb einer im Mittel 12 Tage. Nach großräumige Ausdehnung> 1×10 8 ECFCs können für weitere Tests gewonnen werden. Vorteilhaft mit PHPL den Kontakt von menschlichen Zellen mit Rinderserum Antigene ausgeschlossen werden kann. Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie die isolierten Zellen können als ECFC und ihre in vitro-Funktionalität zu vaskulären Strukturen bilden können in einer Matrigel-Assay getestet werden charakterisiert werden. Weitere können diese Zellen subkutan in einem Mausmodell injiziert werden, um funktionelle, perfundierten Gefäßen in vivo zu bilden. Nach langfristige Expansion und Kryokonservierung Proliferation, erscheinen Funktion und genomische Stabilität zu erhalten. 3,4
Dieses Tier-Protein-freie Isolierung und Expansion Methode ist leicht anwendbar, um eine große Menge an ECFCs generieren.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON TAG 1: Bevor Sie mit Start der Vorbereitung des Experiments das Zellkulturmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Supplement 500ml Endothelial Basal Medium-2 mit Heparin (1ml von 1000 U / ml), 5ml 100x Lösung von Penicillin / Streptomycin (alle Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-Glutamin (2 mM Endkonzentration ) und 50 ml gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL). Dann fügen Sie 0,2 ml Hydrocortiso…
Discussion
Diese neuartige Isolierung und Expansion Methode ist ein einfaches und effizientes Verfahren, die effizienter und weniger zeitaufwendig, indem es jegliche Zellseparation (keine Dichtegradienten erforderlich) und weniger teuer als herkömmliche Techniken. Durch die Verwendung von PHPL Kontakt zu Rindern Antigene und vermeintlichen späteren xenoimmunization ist ausgeschlossen. Während der Kulturzeit kleine Blutgerinnsel bilden können, die durch die PHPL. Basierend auf unserer Erfahrung diese Blutgerinnsel haben keinen …
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL und Margaretha Frühwirth und Daniela Thaler für hervorragende technische Unterstützung.
Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).