Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione
Summary
Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.
Abstract
Un crescente interesse per la biologia delle cellule è quello di esprimere forme transgenically modificato di proteine essenziali (ad esempio, costruisce fluorescente tag e / o varianti mutanti) al fine di indagare la loro distribuzione endogene e rilevanza funzionale. Un approccio interessante che è stato implementato per soddisfare questo obiettivo in cellule altamente differenziate è il<em> In vivo</emTrasfezione> di plasmidi con vari metodi in tessuti specifici, come il fegato<sup> 1</sup>, Muscolo scheletrico<sup> 2,3</sup>, E anche il cervello<sup> 4</sup>. Vi presentiamo qui una descrizione dettagliata dei passi che devono essere seguite per trasfezione efficiente materiale genetico nelle fibre del<em> Flessore breve delle dita</em> (FDB) e<em> Interassea</em> (IO) i muscoli di topi adulti con un<em> In vivo</emElettroporazione> approccio. I parametri sperimentali sono stati ottimizzati in modo da massimizzare il numero di fibre muscolari transfettate, riducendo al minimo i danni dei tessuti che possano compromettere la qualità e la quantità delle proteine espresse in singole fibre. Abbiamo verificato che l'attuazione della metodologia descritta in questo documento si traduce in un rendimento elevato di proteine solubili, cioè EGFP e ECFP<sup> 3</sup>, Calpaina, FKBP12, β2a-DHPR, ecc proteine strutturali, cioè minidystrophin e α-actinina, e proteine di membrana, cioè α1s-DHPR, RyR1, cardiaco Na / Ca<sup> 2 +</sup> Scambiatore Na NaV1.4 canale, SERCA1, ecc, se applicato a FDB, IO e altri muscoli di topi e ratti. L'espressione efficace di alcune di queste proteine è stata verificata con biochimiche<sup> 3</sup> E prove funzionali<sup> 5</sup>. Tuttavia, di gran lunga l'approccio più comune di conferma da noi utilizzati sono standard microscopia a fluorescenza e 2-fotone microscopia a scansione laser (TPLSM), che permettono di identificare non solo l'espressione generale, ma anche la localizzazione dettagliata intracellulare, di costrutti proteina fluorescente tag. Il metodo potrebbe essere ugualmente usato per trasfettare plasmidi che codificano per l'espressione di proteine di rilevanza fisiologica (come mostrato qui), o per interferenza RNA (siRNA), volto a sopprimere l'espressione di proteine normalmente espresse (non ancora testato da noi). Va notato che la transfezione delle fibre muscolari e FDB IO è particolarmente rilevante per lo studio della fisiologia dei mammiferi in quanto le fibre muscolari enzimaticamente dissociato da questi muscoli sono attualmente uno dei modelli più adatti per indagare i meccanismi di base di accoppiamento eccitabilità e di eccitazione-contrazione sotto condizioni di pinza di corrente o tensione<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Descriviamo qui la procedura dettagliata da seguire per raggiungere trasfezioni efficace di plasmidi DNA in fibre muscolari scheletriche di elettroporazione in vivo. I principali vantaggi del nostro approccio sono la semplicità di implementazione, e la sua minima invasività che si traduce in rischio per la salute trascurabile per gli animali. In realtà, i protocolli sopra descritti elettroporazione non implicano molto di più di due iniezioni sottocutanee per piede, seguito da un protocollo di stimolazione e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. T. Otis, Dipartimento di Neurobiologia, UCLA, per condividere l'impianto TPLSM con noi, il Dr. C. Fahlke, Istituto di Fisiologia, RWTH Aachen, in Germania, per la donazione del tipo pEYFP-ClC1 plasmide, e il signor . R. Serrano per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.
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