Summary

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Published: November 13, 2009
doi:

Summary

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Abstract

Usando um conjunto definido de fatores de transcrição e as condições de cultura de células, Yamanaka e seus colegas demonstraram que retrovírus mediada entrega e expressão de Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4 é capaz de induzir pluripotência em fibroblastos de rato 1. Relatórios subseqüentes têm demonstrado a utilidade da doxiciclina (DOX) induzível sistema de entrega lentiviral para a geração de células primárias e secundárias iPS a partir de uma variedade de outros adultos do mouse tipos de células somáticas 2,3.

Pluripotentes induzidas da haste (iPS) são semelhantes às células-tronco embrionárias (ES) células em proliferação, morfologia e capacidade de induzir a formação de teratoma. Ambos os tipos de célula podem ser usados ​​como material de partida para pluripotentes a geração de células diferenciadas ou tecidos em medicina regenerativa. 4-6 células iPS também têm uma vantagem distinta sobre células-tronco embrionárias como eles apresentam propriedades-chave das células-tronco embrionárias sem o dilema ético de destruição de embriões.

Aqui demonstramos o protocolo para a reprogramação embrionárias de rato de fibroblastos (MEF), as células com o induzível DOX Stemgent Set rato TF Lentivirus. Nós também demonstramos que a Stemgent induzível DOX Mouse Set Lentivirus TF é capaz de expressar cada um dos quatro fatores de transcrição em cima de transdução em MEFs induzindo um estado de células-tronco pluripotentes que exibe os marcadores de pluripotência característica de células ES.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Transdução viral de MEFs</p><ol><li> O dia antes de começar sua experiência, o revestimento de um prato de 15 centímetros de cultura celular com 0,2% de gelatina estéril filtrado em DDH<sub> 2</sub> O. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C e 5% CO<sub> 2</sub>.</li><li> Aspirar o líquido do prato de gelatina revestidos, e células de semente MEF (usamos células Nanog-GFP/rtTA MEF) a uma densidade de 4×10<sup> 5</sup> Células por prato. Incubar as células em 30 ml de meio de crescimento MEF (450ml DMEM suplementado com 50 ml FBS, 5 ml 100x não-aminoácidos essenciais, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina e 0,5 ml 55mm β-mercaptoetanol) para dois dias a 37 ° CO C e 5%<sub> 2</sub> Até aproximadamente 80% confluentes.</li><li> Aspirar o meio e adicione 30 ml de MEF meio de crescimento suplementado com lentivírus concentrado (4 x 100 mL de solução stock de vírus + 29,6 ml meio de crescimento). Rocha o prato com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme do médium. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO<sub> 2</sub>.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxiciclina Induzida Reprogramação</p><ol><li> 20-24 horas pós-transdução, as células trypsinize transduzidas, centrifugar a 200 xg por 5 minutos e ressuspender em ES / iPS meio de crescimento (450 ml Knockout DMEM suplementado com 50ml de células ES-qualificados soro bovino, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina, 0,5 ml β-mercaptoetanol e 25 mL LIF). Semente transduzidas MEF em uma concentração adequada para o tamanho do prato de cultura de células (usamos 2,5 x 10<sup> 5</sup> Células por 10 centímetros prato para a reprogramação experimentos de eficiência e isolamento da colônia, e 2 x 10<sup> 4</sup> Células por poço em 4 pratos bem para experimentos ICC). Incubar overnight a 37 ° CO C e 5%<sub> 2</sub>. Nota: as células restantes transduzidas podem ser congelados em nitrogênio líquido para análise futura.</li><li> Aspirar a médio e substituir com ES / iPS meio preparado fresco e suplementadas com doxiciclina para uma concentração final de 2 mg / ml (nós também acrescentou meio sem DOX como controle negativo). Incubar a 37 ° CO C e 5%<sub> 2</sub>.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Análise imunocitoquímica de Eficiência Transdução</p><p class="jove_content"> 48 horas pós-indução de doxiciclina, determinar a eficiência de transdução por imuno-histoquímica (ICC). Realizar testes de ICC em células replated em 4 pratos bem. Todos os volumes listados na seguinte protocolo deverá ser ajustada de acordo com o tamanho da placa de cultura de células.</p><ol><li> Lavar as células com cuidado uma vez com PBS (sem Mg<sup> 2 +</sup> + Ou Ca<sup> 2 +</sup>).</li><li> Fixar as células com 500 mL de 0,5 ml de paraformaldeído 4% em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Permeabilizar as células, adicionando 500 mL de gelada 0,2% Tween ® -20 em PBS. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Bloco de ligação não específica com 200 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.</li><li> Incubar as células com 200 mL do anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C (usamos Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Incubar as células com 200 mL de anticorpo secundário por 1 hora à temperatura ambiente, proteger as placas da luz (usamos Donkey Rodamina conjugado anti-coelho, Donkey Goat anti-AlexaFluor ® 594 conjugado, Donkey anti-Mouse Rodamina conjugado e Donkey anti -Coelho Rodamina conjugado).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Adicionar DAPI (concentração final 2 mg / ml em PBS) e incubar 10 minutos para visualizar núcleos.</li><li> Lave suavemente as células com PBS.</li><li> Adicionar anti-fade Aqua-Mount antes de imagem usando um microscópio invertido de fluorescência.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isolar e expandir colônias iPS celular</p><ol><li> Depois de iniciar o processo de reprogramação (como descrito na seção 2), monitor e substituir as culturas de médio a cada 48 horas. Usamos doxiciclina meio contendo as células de cultura para os primeiros 12 dias e posteriormente removido doxiciclina do meio para garantir que as colônias iPS manualmente escolhido para expansão seria DOX independentes.</li><li> As células devem ser monitorados diariamente por mudanças morfológicas indicativas do processo de reprogramação, ou quando se utiliza células como Nanog-GFP/rtTA MEF, monitor morfologia e fluorescência da GFP para identificar colônias reprogramada. Cada experimento será diferente, mas as colônias são geralmente grandes o suficiente para o isolamento entre os 16 e 22 dias. Colônias identificadas durante este período de tempo pode ser manualmente isolada e tripsinizados para a expansão e análise.</li><li> No dia antes de isolar as colônias e trypsinizing reprogramado, prepare uma placa de 24 poços de semeadura com gama-irradiados feeder layer MEFs a uma densidade de 5 x 10<sup> 4</sup> Células por poço. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5%<sub> 2</sub>.</li><li> Manualmente escolher cada colônia iPS e trypsinize dissociar os agregados celulares. Re-plate as células iPS na ES / iPS meio em poços individuais da placa de 24 poços de pré-semeados com gama-irradiados feeder layer MEFs. Poços devem ser semeadas a uma densidade de 2 x 10<sup> 5</sup> Células / poço. Incubar a 37 ° CO C e 5%<sub> 2</sub>. Mudança de mídia a cada 24 horas.</li><li> Colônias monitor iPS diariamente para o crescimento e fluorescência da GFP. Nós incubar nossas culturas por 6 dias antes passaging.</li><li> Determinar que os poços da placa de 24 poços são uniformemente expressando GFP. Poços que têm expressão GFP bom pode ser tripsinizados e várias passagens 01:08 em 4 bem-placas que foram pré-semeados com gama-irradiados feeder layer MEFs. Estas placas podem ser usadas para a análise do marcador pluripotentes por ICC e coloração AP.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Análise imunocitoquímica de pluripotência</p><p class="jove_content"> Nossos testes ICC foi realizada em células expandidas em 4 pratos bem. Todos os volumes listados na seguinte protocolo deverá ser ajustada de acordo com o tamanho da placa de cultura de células.</p><ol><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS (sem Mg<sup> 2 +</sup> + Ou Ca<sup> 2 +</sup>).</li><li> Incubar em 0,5 ml de gelado 0,2% Tween 20 em PBS por poço por 10 minutos.</li><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS.</li><li> Bloco de ligação não específica com 200 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.</li><li> Incubar as células com 200 mL do anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C (usamos SSEA-1, Nanog e Oct4).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Incubar as células com 200 mL de anticorpo secundário por 1 hora à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos Donkey anti-Mouse Rodamina conjugado e Donkey Rodamina conjugado anti-coelho).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Adicionar DAPI (concentração final 2 mg / ml em PBS) e incubar 10 minutos para visualizar núcleos.</li><li> Lave suavemente as células com PBS</li><li> Adicionar anti-fade Aqua-Mount antes de imagem usando um microscópio invertido de fluorescência.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Fosfatase alcalina de coloração (AP) de colônias de células iPS</p><ol><li> IPS colônias da seção 4 também podem ser analisadas para a atividade AP utilizando kits comercialmente disponíveis e seguindo o protocolo do fabricante.</li></ol><p class="jove_title"> Parte 7. Resultados representante</p><p class="jove_content"> O Stemgent induzível DOX Mouse Set Lentivirus TF pode ser usado para reprogramar as células iPS MEFs. Depois de transdução do MEFs, expressão de fatores de transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc pode ser detectada em células tratadas com doxiciclina (DOX +), mas pouca expressão ou não pode ser detectado em não tratada (DOX) células (figura 1) . Alterações morfológicas vai progredir ao longo do tempo (12 dias de tratamento DOX neste exemplo) para gerar ES maiores, mais semelhantes a células colônias com bordas definidas e três colônias de crescimento dimensional (figura 2a). Quando DOX é removido, há uma reversão notável da morfologia celular para alguns ES celular-como colônias, no entanto, muitas das colônias mantiveram a sua morfologia iPS (figura 2a). Estas colônias iPS, quando escolhido e várias passagens, display expressão do marcador típico pluripotência de fosfatase alcalina (AP), Nanog, Oct4 e SSEA-1 (figura 3). O tipo de células MEF utilizadas neste experimento (células Nanog-GFP/rtTA MEF) expressam GFP do lócus Nanog endógena quando reprogramado para o estado de pluripotência. Expressão GFP pode, portanto, ser usado como um indicador preliminar para a reprogramação de sucesso (figura 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /<strong> Figura 1:</strong> Análise imunocitoquímica (ICC) 48 horas pós-indução DOX. O painel à esquerda (-DOX) é um controle negativo representante para a expressão dos quatro fatores de transdução sem indução DOX. Fatores de transcrição expressado corretamente foram confirmados por meio de anticorpos correspondente (mostrada em vermelho), coradas com DAPI para visualizar o núcleo.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /<strong> Figura 2:</strong> Conversão morfológica de Nanog-GFP/rtTA MEFs ao estado de células iPS. A) imagem de contraste de fase 100x de células demonstrando a compactação e conversão de MEFs em colônias iPS ao longo do tempo a partir de dia 3 (D3 + Dox) para dia 22 (D22). DOX foi retirado no dia 12. Painel esquerdo superior: 20x controle de imagem negativa de-DOX prato. B) 200x de contraste de fase e as imagens de fluorescência da GFP destaque do dia 18 pós-indução DOX colônia iPS. C) 200x de contraste de fase e as imagens de fluorescência da GFP do dia adicional de 18 pós-indução DOX colônia iPS.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /<strong> Figura 3:</strong> Análise de colônias de iPS. (A) A microscopia de contraste de fase e AP coloração de uma colônia iPS (200x). (B) análise de marcador de pluripotência: painel da esquerda mostra overlay de contraste de fase com expressão GFP repórter reprogramação. Expressão GFP reflete o nível de expressão endógena Nanog. Painel do meio mostra ICC coloração para marcadores pluripotência. Painel da direita apresenta coloração DAPI para visualizar os núcleos (100x).</p

Discussion

Estes resultados demonstram que a Stemgent DOX induzível Mouse Set Lentivirus TF pode ser usado para gerar de forma eficiente iPS colônias por induzir a expressão ectópica de transduzidas fatores de transcrição em fibroblastos do ratinho embrionárias. Ao projetar experimentos reprogramação, diversas variáveis ​​devem ser considerados para otimizar a eficiência de reprogramação. Primeiro, é possível modificar a relação célula ativa do vírus em relação ao objectivo (ie MOI) durante a etapa de infecção primária para aumentar ou diminuir a eficiência de transdução, afectando assim o número de vírus integrado na população celular alvo. Segundo, ajustando o tempo de as células são expostas a DOX pode afetar a eficiência de geração de iPS colônia de células. Terceiro, a capacidade proliferativa das células-alvo pode ter impacto reprogramação, as células que estão crescendo ativamente e dividindo são mais passíveis de reprogramação. Por último, ao modificar o protocolo de número de células diferentes ou diferentes tamanho pratos de cultura de tecido, é recomendado que os números de célula-alvo ser ajustado proporcionalmente à área da superfície da placa de cultura.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set   Stemgent 00-0003  

References

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Cite This Article
Hamilton, B., Feng, Q., Ye, M., Welstead, G. G. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System. J. Vis. Exp. (33), e1447, doi:10.3791/1447 (2009).

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