Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang<em> Et al.</em> Per la rilevazione di media 4 ng proteine in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.
Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l'identificazione delle proteine spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine in gel analitici approcci basati sulla proteomica.
Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie 1 sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base 2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo 3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal 4 etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine.
In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.
Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie?
Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi 2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un'alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dott. Nicola Wiethölter per la preparazione e colorazione di 1-D gel.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e sostenuto da una borsa di ricerca dal Manchot Jürgen Stiftung di ND.
Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
For IEF and SDS-PAGE: | |||
Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |