Dies ist ein Verfahren zur Erzeugung gynogenetic diploid Zebrafischembryonen (Embryonen, deren einzige genetische Beitrag kommt von der Mutter) durch die Blockierung der zweiten Reifeteilung unmittelbar nach der Befruchtung mit UV-Licht-inaktivierten Sperma. EP Embryonen sind nicht vollständig homozygot durch Rekombination während der ersten meiotischen Teilung, aber sie sind homozygot überhaupt loci, die nicht von ihrem Zentromer wurden durch Rekombination getrennt.
Abstract
Heterozygotie in diploiden Eukaryoten macht oft genetische Studien umständlich. Methoden, die lebensfähige homozygoten diploiden Nachkommen zu erzeugen direkt aus heterozygoten Weibchen ermöglichen F1 mutagenisierten Weibchen direkt für schädliche Mutationen gescreent werden in einem beschleunigten freuen genetische Bildschirm. Streisinger et al.<sup> 1,2</sup> Beschriebenen Verfahren zur Herstellung gynogenetic (homozygot) diploid Zebrafisch durch Aktivierung Zebrafisch-Eier mit UV-Licht-inaktivierten Spermien und verhindert dadurch entweder der zweiten meiotischen oder das erste zygotischen Zellteilung durch physikalische Behandlungen (Wärme oder Druck), dass deploymerize Mikrotubuli. Die "early pressure" (EP)-Methode blockiert die Meiose II, die kurz nach der Befruchtung auftritt. Die EP-Methode erzeugt einen hohen Anteil an lebensfähigen Embryonen, die zu fruchtbaren Erwachsenen beiderlei Geschlechts entfalten können. Das Verfahren erzeugt Embryonen, die homozygot in allen loci mit Ausnahme derjenigen, die von ihren Centromer durch Rekombination während der Meiose I. Homozygote Mutationen sind in EP Kupplungen zwischen 50% für Zentromer loci und weniger als 1% für Telomer-Loci entdeckt wurden voneinander getrennt sind. Diese Methode stammt wörtlich aus der Zebrafisch Buch reproduziert<sup> 3</sup>.
Protocol
Übersicht der frühen Druck Hinweis: Rezepte für viele der Reagenzien in diesem Protokoll wie Tricaine, Fisch Wasser und Hanks Kochsalzlösung verwendet sind online verfügbar in Kapitel 10 des Zebrafisch-Buch 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html ) Produce Embryonen durch künstliche Befruchtung mittels UV-inaktivierte Spermien. Unmittelbar Übertragung der befruchteten Eizellen zu einem Glasflä…
Discussion
Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Embryonen nach diesem Verfahren hergestellten wahre gynogenetic Diploiden sind. Als Kontrollen erzeugen eine Kupplung von normalen diploiden Eier (indem sie beiseite einige der Spermien ohne UV-Inaktivierung) und eine Kupplung von haploiden Embryonen (indem sie beiseite ein Gelege von Eiern mit UV Spermium befruchtet, ohne durch die EP-Verfahren). An 1 Tag nach der Befruchtung haploide Embryonen haben einen kurzen Körper Achse, unregelmäßige Gehirn und Somiten Morphologie. Hap…
Acknowledgements
Verfahren zur in-vitro-Fertilisation und gynogenetic Diploiden wurden Zebrafisch von Charline Walker in George Streisinger Labor an der University of Oregon in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt. Die hier beschriebene Methode ist unverändert von Charline die Protokolle, die verfügbar sind in voller Höhe in der Zebrafisch Book 3.
Verfahren zur in-vitro-Fertilisation und gynogenetic Diploiden wurden Zebrafisch von Charline Walker in George Streisinger Labor an der University of Oregon in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt. Die hier beschriebene Methode ist unverändert von Charline die Protokolle, die verfügbar sind in voller Höhe in der Zebrafisch Book 3.