Colture primarie di<em> Aplysia</em> Senso-motorie i neuroni fornire una preparazione del modello per studiare la formazione di sinapsi e la plasticità sinaptica<em> In vitro</em>. Questo video dimostra l'identificazione e la microdissezione dei neuroni sensoriali e motori da<em> Aplysia</em> Gangli così come i metodi per stabilire e mantenere senso-motorio neuroni in coltura.
Il sistema nervoso del mollusco marino Aplysia californica è relativamente semplice, costituita da circa 20.000 neuroni. I neuroni sono di grandi dimensioni (fino a 1 mm di diametro) e identificabili, con dimensioni diverse, forme, posizioni e pigmentazioni, ed i corpi cellulari sono esposti esternamente in cinque gangli coppie distribuite in tutto il corpo dell'animale. Queste proprietà hanno permesso agli investigatori di delineare il circuito sottostante comportamenti specifici nell'animale 1. Il collegamento monosinaptico tra i neuroni sensoriali e motori è una componente centrale della branchia-ritiro riflesso nell'animale, un semplice riflesso difensivo, in cui l'animale ritira la sua branchia in risposta alla stimolazione tattile del sifone. Questo riflesso subisce forme di apprendimento non associativo e associative, tra cui la sensibilizzazione, assuefazione e condizionamento classico. Di particolare beneficio per lo studio della plasticità sinaptica, il senso-motorie sinapsi possono essere ricostituita nella cultura, dove ben caratterizzato stimoli suscitare forme di plasticità che si correla direttamente nel comportamento dell'animale 2,3. In particolare, l'applicazione di serotonina produce un potenziamento sinaptico che, a seconda del protocollo di applicazione, durata di minuti (a breve termine facilitazione), ore (medio termine facilitazione) o giorni (a lungo termine facilitazione). Al contrario, l'applicazione della FMRFamide trasmettitore peptide produce un indebolimento sinaptico o depressione che, a seconda del protocollo di applicazione, può durare da minuti a giorni (depressione a lungo termine). Le grandi dimensioni dei neuroni permette di ripetere la registrazione elettrodo affilato di forza sinaptica per periodi di giorni insieme con la microiniezione di vettori di espressione, siRNA e altri composti a target specifici cascate di segnalazione e le molecole e quindi identificare i passi molecolare e cellulare biologici che sono alla base delle modifiche di efficacia sinaptica.
Un ulteriore vantaggio del sistema cultura Aplysia deriva dal fatto che i neuroni dimostrare sinapsi-specificità nella cultura 4,5. Così, i neuroni sensoriali non formano sinapsi con se stessi (autapses) o con altri neuroni sensoriali, né si formano sinapsi con i neuroni motori bersaglio individuato nella cultura. La varicosità, siti di contatto sinaptico tra neuroni sensoriali e motori, sono abbastanza grandi (2-7 micron di diametro) per permettere la formazione delle sinapsi (così come i cambiamenti nella morfologia sinaptica) con i neuroni motori obiettivo da studiare a livello microscopico luce.
In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione senso-motorio culture neurone, tra adulti e anestetizzare Aplysia giovanile, sezionare i loro gangli, la digestione dei gangli della proteasi, la rimozione del tessuto connettivo di microdissezione, l'identificazione di entrambi i neuroni motori e sensoriali e la rimozione di ogni tipo di cellula di microdissezione, placcatura del neurone motore, l'aggiunta del neurone sensoriale e la manipolazione dei neuriti sensoriali per formare il contatto con la cultura del motoneurone.
La preparazione di successo di Aplysia senso-motorie culture ha una curva di apprendimento un po 'lento, in quanto comporta lo sviluppo di abilità motorie associate a microdissezione e la manipolazione di singoli neuroni visto attraverso uno stereo-microscopio. Nella nostra esperienza, ci vogliono circa 1-3 settimane di pratica per ottenere sano neuroni sensoriali isolate nella cultura e settimane supplementari 1-3 per imparare a coppia neuroni sensoriali con i neuroni motori. Noi abitualmente preparare le…
Lavoro in laboratorio che coinvolge la coltura di neuroni Aplysia è finanziato dalla lista NIH R01 e NIH R21MH077921.
Solutions needed for culture
L-15 powder | 13.8g |
NaCl | 15.4 g |
D-Glucose | 6.24 g |
MgSO47H20 | 6.45g |
KCl | 350 mg |
NaHCO3 | 170 mg |
MgCl26H2O | 5.49 g |
CaCl22H2O | 1.43g |
HEPES | 3.53g |