פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.
Abstract
בשנת קלאסית מכתים פרוטוקולים חלבון באמצעות Coomassie מבריק כחול (CBB), פתרונות עם תוכן גבוה של ממיסים אורגניים רעילים דליקים (אתנול או מתנול 2-Propanol) וחומצה אצטית משמשים קיבעון, מכתים ו destaining של חלבונים בג'ל SDS לאחר עמודים. כדי לזרז את ההליך, חימום הפתרון מכתים לתנור המיקרוגל לזמן קצר משמש לעתים קרובות. בדרך כלל גורמת התאדות של מתנול רעילים או מסוכנים, אתנול או 2-Propanol ועל ריח חזק של חומצה אצטית במעבדה אשר יש להימנע בשל שיקולי בטיחות. בפרוטוקול שפורסם במקור בשתי בקשות לפטנט על ידי א.מ. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), הרכב חלופה לפתרון מכתים מתואר בה שום אורגני ממס או חומצה משמש. CBB הוא מומס במים bidistilled (60-80mg ליטר CBB לכל G-250) ו – 35 מ"מ HCl הוא הוסיף כמתחם רק השני בפתרון מכתים. Staning CBB של הג'ל נעשה לאחר שטיפה SDS-PAGE וממצה של הג'ל במים bidistilled. על ידי חימום במהלך ג'ל רחצה ו מכתים שלבים, התהליך יכול להסתיים מהר ולא compunds רעילים או מסוכנים הם מתאדים. צביעה של החלבונים מתרחשת כבר בתוך דקה 1 אחרי חימום ג'ל מכתים פתרון והיא מפותחת אחרי 15-30 דקות עם רקע כחול מעט כי הוא destained לחלוטין על ידי שטיפה ממושכת של הג'ל מוכתמת במים bidistilled, מבלי להשפיע על חלבון מוכתם להקות.
Protocol
חלק 1: הכנת התמיסה מכתים CBB 60-80 מ"ג CBB G-250 הם מומס 1 ליטר מים bidistilled על ידי ערבוב במשך 2-4 שעות. לבסוף, 3 מ"ל של HCl מרוכזת מתווסף הפתרון כחול כהה עם ערבוב עוד דקה ומאוחסנים בחושך לשימוש מאוחר יותר. הפתרון יכול להיות מאוחסן ?…
Discussion
השלבים כביסה הם קריטיים עבור מכתים יעיל של חלבונים. זמן כביסה מופחת מתחת 2 דקות או נפח מופחתת של מים (<50 מ"ל) עלולה לגרום חיוור להקות חלבון כחול, ככל הנראה בשל כמויות גדולות יותר של SDS שאריות הג'ל.
Lawrence, A., Besir, H. Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid. J. Vis. Exp. (30), e1350, doi:10.3791/1350 (2009).