Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.
Abstract
A família<em> Poxviridae</em> Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em> Orthopox</em> Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.
Protocol
Parte 1: síntese de cDNA a partir de RNA Antes de usar o Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, adicionar o volume recomendado de etanol a 100% para os buffers de lavagem. PCR em tubo de reação, adicione entre 100ng de 5μg de RNA total e 1μl de T7 oligo primer (dT). Trazer o volume até 12μl com água livre de nuclease. Incubar as amostras a 70 ° C por 10 min em um termociclador. Remover amostras de RNA a partir de 70 ° C e centrifugar brevemente. Colocar no gelo. <li…
Discussion
Passos crítica
A segunda etapa de amplificação não é aconselhável como preconceitos em dados de matriz foram observados. Misturando com cuidado a cada passo enzimático (1 ª e 2 ª vertente de síntese de cDNA, FPI) é fundamental para a obtenção de rendimentos de amplificação boa, como é de incubação de cada etapa enzimática na temperatura adequada. A cycler PCR com tampa aquecida ajustável é o preferido – desvios ainda tão pequeno quanto 2-3 graus dura…
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2. J. Vis. Exp. (26), e1169, doi:10.3791/1169 (2009).