Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.
Abstract
Le poisson zèbre ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement en imagerie time-lapse de l'embryon vivant transparente. Nous décrivons ici une méthode pour monter embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie et de démontrer comment automatiser la capture de time-lapse images à l'aide d'un microscope confocal. Nous décrivons également une méthode pour créer contrôlée, des dommages précis pour chaque branche d'axones sensoriels périphériques chez le poisson zèbre en utilisant la puissance centrée sur un laser femtoseconde monté sur un microscope à deux photons. Les paramètres pour la réussite à deux photons axotomie doit être optimisé pour chaque microscope. Nous allons démontrer à deux photons axotomie la fois sur une mesure construite à deux photons microscope et d'un Zeiss 510 / confocale à deux photons pour fournir deux exemples.
Zebrafish trijumeau neurones sensoriels peuvent être visualisées dans une ligne de transgéniques exprimant la GFP conduit par un promoteur neurone sensoriel spécifique 1. Nous avons adapté ce modèle de poisson zèbre trijumeau d'observer directement la régénération des axones sensoriels dans la vie des embryons de poisson zèbre. Les embryons sont anesthésiés avec tricaïne et positionnée dans une goutte d'agarose comme il se solidifie. Immobilisé embryons sont scellés dans une chambre remplie d'imagerie phénylthiourée (PTU) de Ringer. Nous avons constaté que les embryons peuvent être continuellement imagée dans ces chambres pour les 12-48 heures. Une seule image confocale est alors capturé afin de déterminer l'endroit désiré de axotomie. La région d'intérêt est située sur le microscope à deux photons par imagerie par les axones sensoriels sous faible, non dommageable pouvoir. Après un zoom avant sur le site désiré de axotomie, la puissance est augmentée et un seul balayage de cette région définie est suffisante pour rompre l'axone. Plusieurs emplacement imagerie time-lapse est alors mis en place sur un microscope confocal d'observer directement la récupération d'une blessure axonale.
Protocol
Discussion
Nous avons utilisé les méthodes décrites avec précision axotomize périphériques axones sensoriels et d'observer directement la régénération chez l'embryon de poisson zèbre vivant. À long terme time-lapse imagerie confocale chez le poisson zèbre peut être utilisé pour observer les nombreux processus développementaux in vivo. La procédure axotomie deux photons décrit peut être modifié pour de nombreuses différentes objectifs expérimentaux. Nous avons utilisé la même procédure gén?…
Acknowledgements
Nous remercions Mark Terasaki pour des conseils initiaux sur l'aide d'un microscope à deux photons pour créer des lésions tissulaires locales, Kathy Joubin des conseils sur le montage d'imagerie time-lapse, et les laboratoires Sagasti et Portera-Cailliau pour les discussions. Les premières expériences ont été effectuées par l'AS en tant que boursier de la Fondation à l'herbe Labs de biologie marine de Woods Hole, MA. Le travail dans le laboratoire Sagasti a été soutenue par des subventions de la Fondation de Whitehall, la Fondation Klingenstein, et un prix du Burroughs Wellcome Fund carrière dans les sciences biologiques.
References
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